暫無數(shù)據

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客戶成就 | Science:引領光電(diàn)聯用新紀元揭示亞細胞三維超微結構


發布時(shí)間(jiān):

2021-09-15

光電(diàn)聯用,顧名思義,就是将同一樣品的光鏡圖像和(hé)電(diàn)鏡圖像進行(xíng)關聯的圖像采集和(hé)處理(lǐ)技(jì)術(shù)。光學顯微鏡的重要優勢體(tǐ)現在其強大(dà)的多(duō)色熒光标記檢測能力以及快速活體(tǐ)多(duō)維成像能力;而電(diàn)子顯微鏡能提供高(gāo)分辨率,但(dàn)其對特異蛋白的标記能力差,多(duō)個(gè)蛋白标記更是難上(shàng)加難,且3D圖像采集速度慢,無法觀察活體(tǐ)。為(wèi)了整合光鏡和(hé)電(diàn)鏡的優勢,光電(diàn)聯用技(jì)術(shù)應運而生(shēng),如今可(kě)謂方興未艾。

     年初,諾貝爾獎得(de)主Eric Betzig領導團隊在Science雜志(zhì)以封面文章形式重磅推出新型冷凍超高(gāo)分辨率光學顯微鏡-3D電(diàn)鏡光電(diàn)聯用技(jì)術(shù),揭示亞細胞三維超微結構。

 

  01    何為(wèi)光電(diàn)聯用?

 

光電(diàn)聯用,顧名思義,就是将同一樣品的光鏡圖像和(hé)電(diàn)鏡圖像進行(xíng)關聯的圖像采集和(hé)處理(lǐ)技(jì)術(shù)。光學顯微鏡的重要優勢體(tǐ)現在其強大(dà)的多(duō)色熒光标記檢測能力以及快速活體(tǐ)多(duō)維成像能力;而電(diàn)子顯微鏡能提供高(gāo)分辨率,但(dàn)其對特異蛋白的标記能力差,多(duō)個(gè)蛋白标記更是難上(shàng)加難,且3D圖像采集速度慢,無法觀察活體(tǐ)。為(wèi)了整合光鏡和(hé)電(diàn)鏡的優勢,光電(diàn)聯用技(jì)術(shù)應運而生(shēng),如今可(kě)謂方興未艾。

 

早期的2D光電(diàn)聯用技(jì)術(shù)隻能應用于較薄的組織和(hé)細胞,形式大(dà)于內(nèi)容,遠不能滿足當今生(shēng)命科學研究的要求。生(shēng)物樣品必然具有(yǒu)三維結構,光切顯微鏡和(hé)3D電(diàn)鏡技(jì)術(shù)都是為(wèi)解析生(shēng)物體(tǐ)三維結構服務的,然而将光電(diàn)聯用技(jì)術(shù)推廣到三維層面是個(gè)全新挑戰。Eric Betzig團隊利用自搭建的超高(gāo)分辨率光學顯微系統,結合蔡司X射線顯微鏡(點擊查看)以及蔡司雙束電(diàn)鏡(點擊查看)雙束場(chǎng)發射3D電(diàn)子顯微鏡,為(wèi)廣大(dà)科研工作(zuò)者提供了一個(gè)理(lǐ)想高(gāo)效的3D光電(diàn)聯用方案。

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▲圖1:完整COS-7細胞Cryo-SMLM和(hé)FIB-SEM的關聯圖


 

  02   冷凍技(jì)術(shù)的妙用

 

冷凍技(jì)術(shù)的應用是全文的靈魂。Eric Betzig團隊将冷凍技(jì)術(shù)作(zuò)為(wèi)重要橋梁,較好的整合了光學超高(gāo)分辨技(jì)術(shù)和(hé)3D電(diàn)鏡技(jì)術(shù)。冷凍技(jì)術(shù)解決了細胞或組織的固定問題
 

任何固定劑的使用都不可(kě)避免的會(huì)引入赝像,而适用于光鏡超高(gāo)分辨率成像和(hé)3D電(diàn)鏡成像的固定條件又不盡相同。為(wèi)此,Eric Betzig團隊另辟蹊徑,選擇利用冷凍固定的方式,最大(dà)程度保存樣品的原始狀态,同時(shí)電(diàn)鏡的染色和(hé)包埋也可(kě)以在低(dī)溫下順利進行(xíng),因此這不失為(wèi)是一個(gè)兩全其美的辦法。

低(dī)溫還(hái)對光學超高(gāo)分辨率成像益處良多(duō)
 

由于共聚焦顯微鏡和(hé)電(diàn)子顯微鏡分辨率差距懸殊,在光電(diàn)聯用的過程中光鏡圖像就顯得(de)過于粗糙了。值得(de)慶幸的是,當今單分子熒光技(jì)術(shù)将光學顯微鏡分辨率推進到了20nm,大(dà)大(dà)提升了熒光定位的準确性。對于很(hěn)多(duō)熒光分子來(lái)說,低(dī)溫可(kě)以增加其暗态的壽命同時(shí)提高(gāo)其成像信噪比。這一優點特别适用于提高(gāo)單分子熒光成像的準确度。除此之外,Eric Betzig團隊已經不滿足于利用液氮來(lái)實現低(dī)溫,而是進一步探索利用液氦将溫度降低(dī)至8K,并且在8K條件下篩選到了2兩種成像效果顯著提升的染料分子。

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▲圖2:過氧化物酶體(tǐ)的形态以及與其它膜結構的相互作(zuò)用


 

簡而言之,液氦冷凍技(jì)術(shù)不僅可(kě)以提高(gāo)熒光顯微鏡的成像效率,還(hái)可(kě)以作(zuò)為(wèi)橋梁将光鏡制(zhì)樣和(hé)電(diàn)鏡制(zhì)樣偶聯在一起。


 

Eric Betzig團隊對這一技(jì)術(shù)進行(xíng)了多(duō)方面的驗證,分别利用Cryo-SIM和(hé)Cryo-SMLM顯微鏡與FIB-SEM進行(xíng)聯用,獲得(de)了大(dà)量從未觀察到的生(shēng)物學現象。例如,對完整細胞進行(xíng)3D光電(diàn)聯用後,作(zuò)者發現了一些(xiē)核內(nèi)的小(xiǎo)泡攜帶ER maker(圖1); 過氧化物酶體(tǐ)随着體(tǐ)積增大(dà)形态不規則性增加(圖2);小(xiǎo)腦(nǎo)顆粒神經元的網狀連接系統(圖3),等等。其中雙色Cryo-SMLM-FIB-SEM對單個(gè)完整細胞關聯的精度高(gāo)達40nm。

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▲圖3:Cryo-SIM/FIB-SEM揭示小(xiǎo)腦(nǎo)顆粒神經元中核內(nèi)結構的分布變化


 

  03   蔡司提供光電(diàn)聯用優質解決方案

 

所謂3D電(diàn)鏡技(jì)術(shù)主要分為(wèi)兩種,一種是基于連續切片技(jì)術(shù),另一種是基于雙束掃描電(diàn)鏡(FIB-SEM),後者的Z軸分辨率顯著高(gāo)于前者,尤其适合于在細胞器(qì)尺度上(shàng)進行(xíng)三維重構。Eric Betzig團隊利用蔡司雙束電(diàn)鏡完成了所有(yǒu)3D電(diàn)鏡圖像采集。
 

蔡司雙束電(diàn)鏡以其高(gāo)靈敏的低(dī)電(diàn)壓成像、超長的穩定工作(zuò)時(shí)間(jiān)和(hé)超大(dà)視(shì)野成像等優勢備受研究者的青睐。蔡司雙束電(diàn)鏡的掃描電(diàn)鏡部分基于熱場(chǎng)發射,其中獨特的Gemini鏡筒內(nèi)電(diàn)子束加減速設計(jì)大(dà)大(dà)降低(dī)了電(diàn)子束能量,同時(shí)保證了電(diàn)子束的質量,進而保證了成像質量。對于生(shēng)物樣品來(lái)說,低(dī)電(diàn)壓高(gāo)襯度成像對樣品結構的保護起到至關重要的作(zuò)用。
 

值得(de)一提的是,為(wèi)了确定雙束顯微鏡挖掘的精确深度,本文作(zuò)者利用蔡司X射線顯微鏡對樹(shù)脂塊進行(xíng)三維掃描,尋找感興趣的區(qū)域,确定其三維坐(zuò)标。蔡司X射線顯微鏡擁有(yǒu)獨特的兩級放大(dà)技(jì)術(shù),可(kě)實現大(dà)樣品的高(gāo)分辨率成像,為(wèi)光電(diàn)聯用架起了一座橋梁。
 

蔡司貫穿超分辨顯微鏡、3D電(diàn)鏡和(hé)X射線顯微鏡的完整産品線為(wèi)光電(diàn)聯用的應用提供了得(de)天獨厚的條件。在蔡司平台下,各款儀器(qì)的軟件和(hé)附件兼容性高(gāo),光電(diàn)聯用實際操作(zuò)将會(huì)成為(wèi)令人(rén)輕松愉快的體(tǐ)驗。

 

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蔡司超高(gāo)分辨率顯微鏡 蔡司X射線顯微鏡  蔡司雙束顯微鏡

 

 

 

參考文獻:

D. P. Hoffman et al., Science 367, eaaz5357 (2020). DOI: 10.1126/science.aaz535

 

文章轉載自蔡司官方微信公衆号“蔡司顯微鏡”。 


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