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重磅 : PD-L1蛋白表達數(shù)字化測定在非小(xiǎo)細胞肺癌組織微陣列中的診斷應
發布時(shí)間(jiān)：
2021-09-15
在腫瘤免疫療法的領域中，非小(xiǎo)細胞肺癌向來(lái)是備受關注的課題。一方面是由于該癌種在亞洲人(rén)群中的高(gāo)發率及病情容易快速惡化，另一方面也是由于近年來(lái)多(duō)個(gè)針對基因突變的靶向療法和(hé)腫瘤免疫療法為(wèi)非小(xiǎo)細胞肺癌的治愈帶來(lái)了新的曙光。随之以來(lái)的是多(duō)重伴随診斷手段在非小(xiǎo)細胞肺癌中的廣泛應用，從EGFR突變液體(tǐ)活檢到基于二代測序的腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden）, 研究人(rén)員都在不停探索新的生(shēng)物标志(zhì)物和(hé)伴随診斷手段。
01 腫瘤免疫學生(shēng)物标志(zhì)物的空(kōng)間(jiān)表達意義
在腫瘤免疫療法的領域中，非小(xiǎo)細胞肺癌向來(lái)是備受關注的課題。一方面是由于該癌種在亞洲人(rén)群中的高(gāo)發率及病情容易快速惡化，另一方面也是由于近年來(lái)多(duō)個(gè)針對基因突變的靶向療法和(hé)腫瘤免疫療法為(wèi)非小(xiǎo)細胞肺癌的治愈帶來(lái)了新的曙光。随之以來(lái)的是多(duō)重伴随診斷手段在非小(xiǎo)細胞肺癌中的廣泛應用，從EGFR突變液體(tǐ)活檢到基于二代測序的腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden）, 研究人(rén)員都在不停探索新的生(shēng)物标志(zhì)物和(hé)伴随診斷手段。
值得(de)注意的是，無論是靶向療法的液體(tǐ)/組織活檢，抑或是部分腫瘤免疫療法提議的腫瘤突變負荷，結果都是基于大(dà)塊組織或者血液中提取的DNA。然而大(dà)部分癌種都存在腫瘤異質性（TumorHeterogeneity），即是同一腫瘤組織中可(kě)能分布多(duō)個(gè)不同的腫瘤細胞克隆。另外不少(shǎo)研究團隊亦已證明(míng)，腫瘤組織中的免疫細胞和(hé)基質細胞在腫瘤中的空(kōng)間(jiān)分布對患者的臨床結果有(yǒu)着重要影(yǐng)響。這些(xiē)發現都指向了空(kōng)間(jiān)信息，特别是不同細胞群落的分布以及它們的互動，極有(yǒu)可(kě)能是腫瘤免疫學的突破口。
的确，在2020年伊始，來(lái)自美國MD Andersen的Jennifer Wargo和(hé)瑞典隆德大(dà)學的Goran Jonsson團隊就在《自然》雜志(zhì)上(shàng)背靠背發表了裏程碑式的發現，通(tōng)過空(kōng)間(jiān)生(shēng)物學的手段在腫瘤組織中發現了三級淋巴結構的存在以及證明(míng)B細胞在病人(rén)存活率中的指向性作(zuò)用。兩篇文章的一大(dà)共同點就是利用了NanoStirng的GeoMxDigital Spatial Profiler對腫瘤組織切片中20到30個(gè)蛋白同時(shí)進行(xíng)原位定量。小(xiǎo)編之前也對這兩篇文章做(zuò)了詳細介紹，感興趣的老師(shī)和(hé)同學也可(kě)以深入研究 （Nature開(kāi)年第三擊-B細胞：腫瘤免疫療法的秘密武器(qì)）。
02 PD-L1在不同細胞中的空(kōng)間(jiān)表達意義
同樣，來(lái)自耶魯大(dà)學病理(lǐ)學主任David Rimm教授研究團隊早在2019年就通(tōng)過GeoMx DSP發現了黑(hēi)色素瘤中巨噬細胞的PD-L1表達 (Toki et al)，較腫瘤細胞的PD-L1表達，與接受腫瘤免疫療法病人(rén)的無進展生(shēng)存期關系更為(wèi)緊密。PD-L1的免疫組化染色向來(lái)是腫瘤免疫療法伴随診斷的金标準。然而圍繞該診斷存在非常多(duō)的擔憂和(hé)争議，包括不同抗體(tǐ)試劑之間(jiān)的差異以及評分方法的主觀性。而且，在PD-L1陰性的患者中，亦有(yǒu)極個(gè)别病人(rén)表現出極優的臨床效果。David Rimm教授的發現在這個(gè)未解之謎上(shàng)打開(kāi)了一個(gè)重大(dà)缺口，說明(míng)了PD-L1的蛋白表達需要結合空(kōng)間(jiān)信息及特定細胞群落分布，才可(kě)能對病人(rén)的臨床效果有(yǒu)更好的指導。
03 免疫細胞的空(kōng)間(jiān)表達意義
在率先發現了PD-L1在黑(hēi)色素瘤病人(rén)的巨噬細胞中的表達後，David Rimm教授團隊近日又進一步探討(tǎo)了非小(xiǎo)細胞肺癌的課題(Zugazugoitia et al)。與黑(hēi)色素瘤相比，非小(xiǎo)細胞肺癌對腫瘤免疫療法的反應率更低(dī)，因此亦需要更精确的診斷标記以求對病人(rén)分組及預後做(zuò)出更好判斷。
研究人(rén)員首先對67個(gè)接受了腫瘤免疫療法單一治療的非小(xiǎo)細胞肺癌組織進行(xíng)了熒光染色，根據癌組織（PanCK），淋巴細胞（CD45）, 巨噬細胞（CD68）和(hé)非淋巴細胞基質細胞的表達對這四個(gè)不同區(qū)域進行(xíng)了劃分。然後，研究人(rén)員對選取的所有(yǒu)四個(gè)區(qū)域上(shàng)對44個(gè)腫瘤免疫學高(gāo)度相關的蛋白進行(xíng)了原位測定.下圖即為(wèi)四個(gè)不同熒光區(qū)域的劃分示意圖。
圖片來(lái)源（Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling. Clinical Cancer Research 2020）
研究人(rén)員發現在這四個(gè)不同區(qū)間(jiān)中，不同免疫細胞的空(kōng)間(jiān)分布對于病人(rén)預後有(yǒu)着預測性意義。比如淋巴細胞群落中的CD56 NK細胞和(hé)CD4 T 細胞高(gāo)表達對于病人(rén)的無進展生(shēng)存期和(hé)總生(shēng)存期都有(yǒu)着良好的預後。相反，其他細胞群落中的CD56 NK細胞和(hé)CD4 T 細胞表達則與病人(rén)的預後無關。這也和(hé)之前部分研究中提示NK 細胞有(yǒu)可(kě)能作(zuò)為(wèi)腫瘤免疫療法的生(shēng)物标志(zhì)物的發現吻合。然而空(kōng)間(jiān)信息的出現，再次證明(míng)腫瘤微環境的高(gāo)度複雜性不能依賴大(dà)塊組織的單一手段來(lái)解讀，通(tōng)過加入空(kōng)間(jiān)信息這一變量，不同病人(rén)組别數(shù)據的分辨度更清晰。值得(de)注意的是，在這個(gè)實驗中， 全部44個(gè)蛋白的表達量都是數(shù)字化測定，而非根據目測評分決定。因此并不存在傳統免疫組分染色由于主觀因素帶來(lái)的偏差。
圖片來(lái)源（Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling. Clinical Cancer Research 2020）
另外研究人(rén)員亦發現兩個(gè)新型标記物VISTA和(hé)CD127同樣對于非小(xiǎo)細胞肺癌的病人(rén)免疫療法預後有(yǒu)着良好的預測效果。這兩個(gè)标記物都屬于腫瘤免疫檢查點系統的一部分，往往在PD-1免疫抑制(zhì)劑療法中通(tōng)過代償機制(zhì)升高(gāo)。有(yǒu)趣的是，VISTA和(hé)CD127的表達升高(gāo)都是體(tǐ)現在腫瘤細胞群落，說明(míng)這個(gè)代償機制(zhì)是腫瘤細胞對于由于免疫療法帶來(lái)的攻擊産生(shēng)的抵抗，有(yǒu)效證明(míng)了免疫療法在這些(xiē)病人(rén)當中起了積極作(zuò)用。
04 PD-L1空(kōng)間(jiān)表達數(shù)字化定量
上(shàng)文中提到過，David Rimm 教授團隊在2019年就發現黑(hēi)色素瘤中巨噬細胞的PD-L1表達水(shuǐ)平與病人(rén)預後高(gāo)度相關。然而在非小(xiǎo)細胞肺癌病人(rén)中，PD-L1的表達量卻在不同的細胞群落中無顯著差别。這說明(míng)了即便如PD-L1這樣的重量級生(shēng)物标記物，在不同癌種的空(kōng)間(jiān)表現乃至臨床預測都可(kě)能不盡相同，進一步說明(míng)了在今後的腫瘤免疫研究中，研究人(rén)員在開(kāi)發伴随診斷的時(shí)候需要結合空(kōng)間(jiān)信息與基因/蛋白表達量。
在這一方面，David Rimm教授的團隊再次提出了數(shù)字化測定PD-L1 表達量的概念。在另一篇剛剛發表的文獻中 （Gupta et al, 2020）， 同一研究團隊采用了标準化的組織微陣列和(hé)10個(gè)不同細胞株，對PD-L1的表達在不同平台上(shàng)進行(xíng)了測定，其中包括多(duō)個(gè)FDA認證的PD-L1免疫組化試劑盒，GeoMx DSP和(hé)免疫熒光染色。實驗結果表明(míng)GeoMx DSP不僅與傳統的免疫組化和(hé)免疫熒光染色結果在組織微陣列及細胞株中高(gāo)度吻合，更是通(tōng)過數(shù)字化的讀取提供定量結果，在将來(lái)有(yǒu)可(kě)能會(huì)成為(wèi)新的PD-L1伴随診斷手段.
05 組織微陣列在伴随診斷開(kāi)放中的應用
老師(shī)同學們或許都已經注意到，David Rimm教授團隊在實驗中大(dà)量應用到組織微陣列。在過往，大(dà)部分的免疫組化實驗都是基于大(dà)塊組織切片。上(shàng)文提到的MD Anderson和(hé)隆德大(dà)學的兩篇文章都是基于可(kě)切除黑(hēi)色素瘤，較易切除獲取大(dà)塊組織。然而對于非小(xiǎo)細胞肺癌來(lái)說，由于腫瘤組織更為(wèi)深入體(tǐ)內(nèi)，往往需要細針活檢或者開(kāi)胸手術(shù)才能獲取。這也是為(wèi)什麽在非小(xiǎo)細胞肺癌中，液體(tǐ)活檢越來(lái)越受歡迎的原因。在一般病理(lǐ)學分析中，大(dà)塊腫瘤組織更能提供全方位的信息，當出現組織樣本稀少(shǎo)的情況下，組織微陣列（TissueMicroarray）就成為(wèi)了最佳選項。組織微陣列是通(tōng)過将多(duō)個(gè)石蠟組織包塊上(shàng)的組織活細胞轉移到一個(gè)新的石蠟塊上(shàng)，從而構建出微型化共同量的組織陣列，以有(yǒu)效地進行(xíng)臨床病理(lǐ)組織的觀察和(hé)研究。雖然有(yǒu)部分聲音(yīn)對于組織微陣列備樣過程中可(kě)能出現的樣品污染和(hé)取樣時(shí)出現以偏概全的可(kě)能性抱有(yǒu)懷疑，但(dàn)是假如腫瘤免疫療法的将來(lái)需要面對大(dà)規模開(kāi)發新型空(kōng)間(jiān)生(shēng)物學标志(zhì)物，目前珍貴的臨床樣品勢必面臨枯竭的問題。但(dàn)是通(tōng)過合并高(gāo)通(tōng)量的空(kōng)間(jiān)生(shēng)物學平台如GeoMx DSP和(hé)組織微陣列，研究人(rén)員也是實現在短(duǎn)時(shí)間(jiān)內(nèi)可(kě)以快速篩選蛋白或RNA生(shēng)物标記物。值得(de)注意的是，文中所用到的GeoMx DSP，提供四個(gè)熒光标記物的選項。當研究人(rén)員通(tōng)過選取感興趣區(qū)域（Region of Interest, ROI）并建立不同區(qū)塊或細胞群落模型後，GeoMx DSP就可(kě)以全自動化的對一張組織微陣列上(shàng)的所有(yǒu)樣本逐一進行(xíng)選樣，并且在這個(gè)過程中保持樣本的完整性，以便用于下一輪篩選。
06 展望未來(lái)
通(tōng)過David Rimm教授團隊的發現，我們不難看到腫瘤免疫療法的生(shēng)物标記物開(kāi)發仍然有(yǒu)着很(hěn)長一段路要走。目前PD-L1 仍是單一生(shēng)物标記物的黃金标注，但(dàn)是免疫組化染色存在的偏差不得(de)不讓人(rén)考慮采用數(shù)字化定量系統的可(kě)能性。此外，許多(duō)對腫瘤免疫療法有(yǒu)着良好治療反應的腫瘤中，PD-L1陽性的患者很(hěn)少(shǎo)，種種數(shù)據都證明(míng)，除了PD-L1之外，還(hái)有(yǒu)更多(duō)生(shēng)物标志(zhì)物的空(kōng)間(jiān)信息及其臨床意義有(yǒu)待發現。而且許多(duō)癌種包括乳癌和(hé)大(dà)腸癌仍是有(yǒu)待開(kāi)發。假如老師(shī)和(hé)同學們想了解更多(duō)關于GeoMx DSP在腫瘤學中空(kōng)間(jiān)生(shēng)物标記物的發現，可(kě)以登記參加于周四舉行(xíng)的線上(shàng)研討(tǎo)會(huì)，我們的專家(jiā)将詳細解釋包括Jennifer Wargo， David Rimm團隊在內(nèi)發表于自然雜志(zhì)的文獻和(hé)實驗思路，以期幫助研究人(rén)員更快地開(kāi)拓空(kōng)間(jiān)生(shēng)物學在腫瘤免疫學的應用。
文 獻
1.Gupta et al, Digital Quantitative Assessment of PD-L1using digital spatial profiling:
2. Zugazugoitia et al, Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling
3. Toki et al. High-Plex Predictive Marker Discovery for MelanomaImmunotherapy-Treated Patients Using Digital Spatial Profiling.
關于NanoString生(shēng)物技(jì)術(shù)
自從2008年《NatureBiotechnology》期刊以封面文章形式報道(dào)了NanoString的突破性技(jì)術(shù)後，至今已有(yǒu)近3000篇應用該技(jì)術(shù)的生(shēng)物醫(yī)學文獻。其中多(duō)篇文章發表在《Cell》，《NatureMedicine》等頂級雜志(zhì)上(shàng)。NanoString的數(shù)字化基因檢測技(jì)術(shù)（nCounterAnalysis)是最新一代的多(duō)重核酸定量技(jì)術(shù)，在轉化醫(yī)學與臨床應用中扮演越來(lái)越重要的角色。
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